Từ những năm 80 của thế kỷ trước, sự thành công của “kỹ thuật nhận dạng” và “giải trình tự gen” đã tạo ra bước nhảy vọt cho việc tổng hợp chuỗi gen PCR (polymerase chain reaction). Kỹ thuật này đã giúp cho việc xác định nguyên nhân gây bệnh được nhanh chóng và chính xác cũng như giúp cho quá trình theo dõi, điều trị hiệu quả.
Xét nghiệm sinh học phân tử là gì?
Phản ứng tổng hợp PCR có khoảng 20 - 35 vòng, sau mỗi vòng thì DNA được khuếch đại lên theo hệ số mũ. Cho nên phản ứng PCR thực chất là phản ứng “nhân bản, khuếch đại các đoạn DNA”. Năm 1983, Kary Mullis đã nghiên cứu thành công kỹ thuật tổng hợp PCR giúp cho việc nhận diện vi sinh vật gây bệnh một cách nhanh chóng. Đây là kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử. Xét nghiệm này thoạt đầu trả lời được câu hỏi định tính (Trong mẫu thử có vi sinh đó không?).
Năm 1991, các nhà nghiên cứu tìm được cơ chế hoạt động theo chu trình từ đầu 5 đến đầu 3 của DNA - polymerase, từ đó cho phép việc ghi tín hiệu trực tiếp, tức thời các quá trình xảy ra trong phản ứng tổng hợp PCR. Kỹ thuật ghi tín hiệu này có thuật ngữ là “Real - time PCR”. Phản ứng trong “Real - time PCR” cao hơn trong PCR khoảng 50 - 60 vòng. So sánh số vòng xảy ra trong mẫu thử gấp bao nhiêu lần trong mẫu chuẩn ta sẽ tính được lượng vi sinh trong mẫu thử. Như vậy kỹ thuật “Real - time PCR” sẽ trả lời được câu hỏi định lượng (Có bao nhiêu vi sinh trong mẫu thử?).
Vi sinh phải có mặt với một số lượng đủ lớn mới gây ra được bệnh. Phản ứng tổng hợp PCR cho phép ta nhận diện sự có mặt của vi sinh và phản ứng “Real - time PCR” cho ta định lượng được số vi sinh trong mẫu thử, do đó sẽ giúp cho việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh.
Khi dùng một liệu pháp nào đó để tiêu diệt vi sinh gây bệnh thì không bao giờ tiêu diệt hết 100% vi sinh mà chỉ làm giảm vi sinhh đến mức tối thiểu. Dùng phản ứng tổng hợp PCR và kỹ thuật “Real - time PCR” sẽ cho phép ta định tính và định lượng vi sinh ở từng thời điểm trong sau điều trị tức là cho phép đánh giá kết quả điều trị.
 Làm xét nghiệm sinh học. |
Những yêu cầu khắt khe về kỹ thuật và sự sai sót hạn chế
Xét nghiệm sinh học phân tử phải được thực hiện trong điều kiện kỹ thuật rất khắt khe, nếu không thực hiện đúng các điều kiện khắt khe ấy thì sẽ có sai sót hạn chế:
Trong kỹ thuật tổng hợp PCR: Nếu nồng độ nguyên liệu không thích hợp, việc điều nhiệt tức thời không đúng theo từng giai đoạn, thì phản ứng tổng hợp PCR sẽ có hiệu suất rất thấp, thậm chí có thể không xảy ra. Kết quả là phản ứng PCR âm tính, mặc dù các triệu chứng nhiễm vi sinh trên lâm sàng rất rõ. Nếu vô ý để xảy ra “sự nhiễm chéo” giữa các mẫu thử thì sẽ có phản ứng PCR dương tính, mặc dù các triệu chứng nhiễm khuẩn trên lâm sàng rất mờ nhạt.
Về kỹ thuật “Real - time PCR”: Ngoài một số chi tiết như kỹ thuật tổng hợp PCR thì quan trọng nhất là có thêm một thiết bị ghi tín hiệu khi phản ứng tổng hợp PCR xảy ra. So sánh số vòng của mẫu thử và số vòng của mẫu chuẩn đạt được trong cùng thời gian xảy ra phản ứng, sẽ tính được số vòng mẫu thử gấp bao nhiêu lần số vòng mẫu chuẩn; từ đó tính được nồng độ DNA của mẫu thử. Như vậy, trong giai đoạn này đòi hỏi phải có một mẫu chuẩn tốt để so sánh.
Muốn định lượng mẫu thử đúng thì mẫu chuẩn phải chính xác. Để loại trừ sai sót gây ra, thường phải so sánh một mẫu thử với 5 mẫu chuẩn liên tiếp có nồng độ chênh lệch nhau và bao giờ các kết quả của mẫu thử sau 5 lần so với các mẫu chuẩn ấy không có sự chênh lệch nhau quá giới hạn cho phép thì mới chấp nhận. Điều này đòi hỏi cả kỹ thuật lẫn sự kiên nhẫn cao. Không làm được điều này thì kết quả sẽ sai lạc.
Có hai hạn chế trong xét nghiệm sinh học phân tử:
Mẫu chuẩn với mẫu thử chỉ đúng trong phạm vi nồng độ giới hạn, chứ không đúng với mọi nồng độ. Do đó, chỉ có thể định lượng được mẫu thử trong phạm vi nồng độ giới hạn, ngoài khoảng đó ra, sẽ không chính xác.
Vi sinh gây bệnh thì rất nhiều loại, trong khi đó ta mới chỉ có bản “giải trình tự gen” của một số ít vi sinh. Do đó không phải bệnh do vi sinh nào cũng có thể xét nghiệm bằng kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử được.
Như vậy, xét nghiệm sinh học phân tử tuy rất hiện đại song vẫn có thể có những hạn chế và có thể có sai sót do chính việc thực hiện của con người.
Tương lai và sự ứng dụng
Có rất nhiều vi sinh gây bệnh đặc biệt là các chủng mới như HIV, viêm gan B (HBV), cúm A/H5N1, cúm A/H1N1, SARS..., mà nếu dùng phương pháp xét nghiệm vi sinh cổ điển sẽ không thể xác định hay đáp ứng chậm thì phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử sẽ đáp ứng được và đáp ứng nhanh hơn, nhờ đó mà giúp cho việc chẩn đoán cũng như đánh giá hiệu quả điều trị một số bệnh kịp thời.
Sự thay đổi môi trường, lối sống cộng với sự thay đổi của các tác nhân gây bệnh, làm cho việc giải thích bệnh sinh không đơn giản, mà cần phải giải thích bằng mối tương tác phức tạp của nhiều tác nhân. Chẳng hạn, trong bệnh ung thư thì đâu là sự tàn phá do nhiễm khuẩn, đâu là sự suy kiệt do các hội chứng rối loạn chuyển hóa dai dẳng và đâu là tác động trường diễn của các chất độc trong tự nhiên... Thông qua kỹ thuật tổng hợp PCR và “Real - time PCR” có thể trả lời được các câu hỏi hóc búa trên một cách lý thú và đáng tin cậy.
Tuy nhiên, xét nghiệm sinh học phân tử là kỹ thuật cao, tốn kém và cũng có mặt hạn chế chỉ nên dùng khi các kỹ thuật cổ điển đáp ứng thấp. Các cơ sở khám chữa bệnh chỉ nên sắm các thiết bị này khi hội đủ các điều kiện nhân lực, kỹ thuật với mục đích thiết thực. Người bệnh không nên lạm dụng các xét nghiệm theo ý thích mà tuân thủ sự chỉ dẫn của thầy thuốc.
|
|